如何用比色法对细胞进行计数？

在生物学和医学研究中，细胞计数是一项基础且重要的实验技术。传统的细胞计数方法如血球计数板虽然直观，但操作繁琐且易引入误差。相比之下，比色法，特别是MTT（3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，即噻唑蓝）比色法，以其高灵敏度和经济性，在细胞存活和生长检测中得到了广泛应用。本文将详细介绍MTT比色法的原理、实验步骤及其在细胞计数中的应用。

MTT比色法原理

MTT比色法是一种基于活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性的检测方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞内。而死细胞由于缺乏此酶活性，无法形成甲瓒结晶。随后，利用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒结晶，并通过酶联免疫检测仪在特定波长（通常为490nm或570nm）下测定其光吸收值（OD值），从而间接反映活细胞的数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

实验步骤

1. MTT溶液的配制

• 材料：MTT粉末、磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）或无酚红的培养基、0.22μm滤膜、铝箔纸。

• 步骤：称取MTT 0.5克，溶于100ml PBS中，用0.22μm滤膜过滤以除去细菌，放4℃避光保存。配制过程中，容器最好用铝箔纸包住以避免光照分解。

2. 细胞接种与培养

• 材料：培养瓶、96孔板、移液管、培养基（含10%胎小牛血清）、胰蛋白酶等。

• 步骤：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至适当范围（如1000-10000个/ml），接种于96孔板中，每孔加入100-200μl细胞悬液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养至细胞贴壁或达到实验所需状态。

3. MTT处理与孵育

• 步骤：向每孔加入10μl MTT溶液（5mg/ml），继续培养4小时。MTT被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为甲瓒结晶并沉积在细胞内。

4. 结晶溶解与比色

• 步骤：终止培养后，小心吸去孔内培养液（对于悬浮细胞需先离心）。每孔加入100μl DMSO，置摇床上低速振荡10分钟，使甲瓒结晶充分溶解。使用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长下测定各孔的光吸收值（OD值）。

5. 数据处理与分析

• 步骤：记录各孔的OD值，根据实验设计进行数据处理和分析。通常，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线，以反映细胞增殖情况。

应用与注意事项

应用

MTT比色法已广泛用于生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等领域。其高灵敏度和经济性使得该方法成为细胞生物学研究中的重要工具。

注意事项

1. MTT溶液的配制与保存：MTT溶液应现用现配，避免反复冻融。配制好的溶液应置于4℃避光保存，并在两周内使用完毕。

2. 细胞接种浓度与培养时间：选择合适的细胞接种浓度和培养时间对于实验结果的准确性至关重要。不同细胞类型的最佳接种浓度和培养时间可能有所不同，需通过预实验确定。

3. 实验条件控制：实验过程中应严格控制培养条件（如温度、CO2浓度等），以减少外界因素对实验结果的影响。

4. OD值范围：为了保证实验结果的线性关系，MTT实验的OD值最好在0-0.7范围内。超出此范围时，OD值与细胞数之间的线性关系可能不再成立。

5. 防止污染：实验过程中应注意无菌操作，避免细胞污染对实验结果的影响。

结论

MTT比色法作为一种高效、灵敏的细胞计数方法，在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。通过掌握其原理、实验步骤及注意事项，可以更加准确地进行细胞计数和生长状况分析，为科学研究提供有力支持。