如何从样品预处理角度，提高支原体检测的准确性

支原体放行检测，在临床相关的项目中发挥着重要作用。常见的一些研究，如干细胞治疗项目、免疫细胞治疗项目研究、CAR-T项目研究、抗体药研究、疫苗等领域，以及还有一些重要的细胞培养、细胞典藏项目，都需要对培养的细胞或收获的产物，进行准确度较高的支原体检测，以保证产物没有支原体污染。

qPCR法是十分常用的支原体检测方法。药典中指出，通过方法学验证，即在检测限、特异性和耐用性等方面达到要求后，才能替代传统的检查方法。因此，qPCR实验的结果的稳定性与精准度，直接关系到方法学验证是否可信。

除了实验操作、所选择的试剂盒等常见的影响因素，待检样品的预处理方法，也会对qPCR检测结果造成不同程度的影响。

用于支原体检测的样品的成分通常比较复杂，可能存在抑制PCR的物质，影响qPCR实验的结果。在进行qPCR检测之前，需要将样品中的支原体DNA纯化出来，以确保检测的准确性和灵敏度。

进行DNA提取的优势：

1、提高检测的准确性：DNA提取可以有效地从复杂样品中分离出支原体的DNA，避免杂质对检测结果的干扰，从而提高检测的准确性，降低假阳性结果的可能性。

2、增加检测的灵敏度：通过DNA提取，可以将支原体的DNA浓缩到较高的水平，使其在qPCR中的检测限度更低，提高了检测的灵敏度，即能够检测到更低浓度的支原体。

3、节省成本：虽然DNA提取可能需要一定的时间和成本，但它可以避免由于假阳性结果而带来的额外成本，如错误的结果导致方法学验证失败等。

因此，当待检样品如果存在以下几种情况（包括但不限于），需要对样品进行DNA提取处理，以提高支原体检测的灵敏度：

1、细胞培养基中的血清浓度如果超过12%，那么对下游的PCR反应会产生抑制。酚红，对荧光定量PCR的检测也会干扰。这些均可以通过使用德国Miverva Biolabs公司的支原体DNA提取试剂盒来解决。

2、对于样品类型是细胞团、疫苗、冻存细胞和石蜡包埋的组织，需要提前提取DNA。

3、如果样品中蛋白含量高于10mg/ml，则先需要用蛋白酶K进行处理，再用原体DNA提取试剂盒提取样品中的DNA。

德国Minerva Biolabs公司生产的Venor®GeM Sample preparation Kit支原体DNA提取试剂盒，可实现支原体检测方法验证过程中的样品制备步骤，包括DNA提取和纯化，可防止可能干扰qPCR扩增的污染物或抑制剂的引入。从细胞上清和生物制品中分离支原体DNA，全程只需30分钟。该试剂盒的操作分四步：细胞溶解，DNA特异性与层析柱结合，祛除残留的污染物和抑制剂，洗脱DNA。

该试剂盒符合欧洲药典规范，配合支原体qPCR检测试剂盒、支原体标准品一起使用，通过欧洲药典的方法学验证，助力新药上市。