简析我国药典中对新生牛血清的要求

我国药典中规定，新生牛血清是从出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清，经除菌过滤后制成。牛血清生产过程中不得任意添加其他物质成分。新生牛血清应进行以下检查，符合规定后方可使用。

如釆用经过验证的病毒灭活工艺处理的牛血清，大肠埃希菌噬菌体及病毒检测必须在灭活前取样进行。

pH值：应为7.00~8.50。

蛋白质含量：采用双缩脲法（通则0731第三法）或其他适宜方法测定，应为35~50g/L。

血红蛋白：用分光光度法或其他适宜的方法测定，应不高于200mg/L。

渗透压摩尔浓度：应为250~330mOsmol/kg（通则0632）。

细菌内毒素检查：应不高于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。

支持细胞增殖检查：采用传代细胞（HFL1、Mv1 Lu、Vero和CHO）中的任意1种细胞及Sp2/0-Ag14细胞进行。细胞复苏后，用待测样品配制的培养液至少连续传3代后使用，取对数生长期的细胞用于试验。

（1）细胞生长曲线的测定  取供试品按10%浓度配制细胞培养液，Sp2/0-Ag14按每1ml含1×10^4的细胞浓度，其他贴壁细胞按2×104的细胞浓度接种细胞，每天计数活细胞，连续观察1周，并绘制生长曲线。

（2）细胞倍增时间的测定  按生长曲线计算细胞的倍增时间。取细胞峰值前一天的细胞计数（Y）、接种细胞数（X）及生长时间（T）计算。

Sp2/0-Ag14细胞应不超过20小时；HFL1细胞应不超过22小时；Mv1 Lu细胞应不超过24小时；Vero细胞应不超过18小时；CHO细胞应不超过22小时。

（3）克隆率的测定  将细胞稀释至每1ml含10个活细胞的浓度，按每孔1个细胞接种于96孔细胞培养板，每板至少接种60孔，于37℃、5%二氧化碳培养，定期观察细胞克隆生长情况，培养1周后计数每孔中的细胞克隆数，并计算克隆率，应不低于70%。

无菌检查：依法则检查（通则1101），应符合规定。

支原体检查：依法则检查（通则3301），应符合规定。

大肠埃希菌噬菌体：采用噬斑法和增殖法检测。不得有噬菌体污染。

病毒检查：

（1）样品制备　取约250ml的新生牛血清供试品用于检测，将其配制成含15%供试品的培养液，用于检测全过程的细胞换液及传代，以检测合格的血清作为阴性对照血清。

（2）指示细胞制备　至少采用猴源（如Vero细胞）、2种牛源细胞（BT和MDBK细胞或无病毒污染的原代牛肾细胞）以及人二倍体细胞作为指示细胞，细胞复苏后至少传代1次后使用，根据所需量制备足够量的细胞。

（3）用含有供试品的培养液将4种指示细胞分别接种于75cm2细胞培养瓶中，接种量应使细胞在培养7天后可达到至少80%～90%汇合。同时制备阴性对照血清培养瓶。将培养瓶置37℃、5%CO2培养箱中培养至少7天。可在第5天时换液一次。

（4）第7天进行第1次盲传，将接种供试品及阴性对照的每种指示细胞培养瓶分别传出至少2个75cm2培养瓶，继续培养至第14天，在第12天时可换液一次。

（5）在第13天时（或第2次传代前1天）或阴性对照瓶细胞达到至少70%汇合时，制备阳性对照用细胞。即取1个阴性对照细胞瓶分别传至6孔板或其他适宜的细胞板中用于细胞病变观察（CPE）、血吸附检查（HAd）及荧光抗体检测（IF），次日接种阳性对照病毒。

（6）第14天时进行第2次盲传。将第1次传代后的细胞培养物分别传至6孔板或其他适宜的细胞板中，进行细胞病变观察及HAd检查时，接种于每种指示细胞上的待测样本至少接种3孔；进行荧光抗体检测时，接种于每种指示细胞上的待测样本进行每种病毒检测时至少接种2孔。继续培养至少至第21天，剩余细胞样本－60℃或以下保存备用。

（7）在第14天接种阳性对照病毒：取（5）制备的指示细胞接种适量阳性对照病毒，置36℃±1℃、5%CO2培养箱吸附2小时，吸弃上清液，加入适量细胞维持液，置36℃±1℃、5%CO2培养箱培养7天，对于BT细胞，BVDV可作为病变阳性对照，BPI3可作为HAd阳性对照，牛副流感病毒3型（PI3）、牛腺病毒（BAV-3）、牛细小病毒（BPV）以及牛腹泻病毒（BVDV）可作为IF检测阳性对照；对于MDBK细胞，呼肠孤病毒3型（REO3）和PI3可分别作为细胞病变及HAd检查阳性对照，PI3、BAV-3、BVDV、REO-3为IF检测阳性对照；对于Vero细胞，Pl3可作为细胞病变及HAd检查阳性对照，PI3及REO-3作为IF检测阳性对照。可不设立狂犬病病毒（Rabies）阳性对照。所有IF检测阳性对照病毒应接种100～300CCID50。

（8）接种阴性对照及供试品的细胞培养物在接种后每日观察细胞病变情况，在接种后至少21天或末次传代后至少7天时分别进行病变观察、HAd检查及IF检测，阳性对照培养物在接种后第7天或10%细胞出现CPE时可进行IF检测。

进行血吸附检查时，用鸡与豚鼠血红细胞在2～8℃及20～25℃进行检测。

进行荧光抗体检测时，将细胞固定后采用直接或间接免疫荧光抗体检查法，至少应对BVDV、PI3、BAV-3、BPV、REO3以及 Rabies进行检查，结果均应为阴性。

（9）结果判定　阴性对照应无细胞病变，血吸附检查应为阴性，荧光抗体检测应为阴性；阳性对照应有明显的细胞病变，血吸附检查应为阳性，荧光抗体检测应为阳性，判为试验成立。供试品如无细胞病变，血吸附检查为阴性，且荧光抗体检测为阴性，判定为符合要求。待测样本如出现细胞病变，或血吸附检查为阳性，或任何一种荧光抗体为阳性，则判定为不符合要求。

经病毒灭活处理的牛血清，灭活前取样检测后若任何一项检测显示为阳性，不建议用于生产。除非可鉴别出污染的病毒，且病毒灭活工艺验证研究显示其污染量可被有效灭活时方可使用，如果灭活前BVDV病毒检测为阳性，灭活后还应取样采用敏感的方法检测BVDV，结果阴性为符合要求。

未经病毒灭活处理的牛血清若任何一项检测显示为阳性，则不得用于生产。

不能用感染试验检测的牛源性病毒可采用核酸检测法，但应采用较大量的样品提取核酸（如25～50ml的血清样本），并计算合并血清的检测限。