支原体PCR检测——德国MB Venor Gem Classic使用指南

支原体污染是细胞培养实验中，较为常见又十分棘手的问题。日常实验中，需要对细胞培养环境定期清洁；对细胞培养上清液、培养基和生物制药生产环节进行的支原体污染监测。寻找一种快速、可靠和节省时间的常规监测手段对于提高实验效率、维持实验结果的稳定十分重要。

德国Minerva Biolabs公司生产的Venor®GeM经典试剂盒，为检测细胞培养物和其他生物基质中支原体而设计。基于传统PCR方法，可实现快速、稳健、高灵敏度的支原体污染检测。

产品名称：支原体常规PCR检测试剂盒

英文：Venor® Gem Classic    

品牌：Minerva-Biolabs®    

货号：11-1025

规格：25次/盒  

产品特点及原理

该试剂盒针对支原体基因组中的一个高度保守区域：16s rRNA编码区，以检测欧洲药典第2.6.7章(EP 2.6.7)、日本药典第G3章(JP G3)和更多物种中包含的所有物种，根据支原体种类的不同，扩增子的大小在265-278 bp之间。

试剂盒设计满足EP 2.6.7和JP G3不同样品材料(如细胞培养上清、细胞培养基、Tris缓冲液)的检测标准。该检测方法适用于通常用于研究的细胞培养上清、“细胞培养富集"方法或DNA提取后的支原体直接检测。该试剂盒符合EP 2.6.7和JP G3的要求。

整个测试仅需要3小时左右的时间，并且与基于发光的酶测定、荧光染色或培养方法相比，不需要活的支原体细胞。

使用方法详解

一、普通细胞培养物的预处理

当细胞培养达到80% - 90%的融合度时，收集样品。细胞培养上清液非常适合支原体试验，不需要额外的样品制备。

细胞培养中支原体的平均滴度为10^6-10^8颗粒/ ml。在此范围内，上清液中存在足够数量的支原体DNA，可以成功应用PCR检测。

1. 从细胞培养液中取100µl上清至1.5 ml反应管中。把盖子盖紧。

2. 将样品上清液在95℃下孵育10分钟(至少5分钟)。

3.以最大转速离心样品。15秒的速度使细胞碎片成颗粒。

4. 直接使用2µl进行PCR，或在+2至+8°C或≤- 18°C下长期保存样品6天。

二、.生物药或需遵循药典的预处理

1、样品富集

（可根据实际情况选做）

对于样品体积> 200µl，建议采用样品富集的方法以获得最佳灵敏度。请注意，样品浓度方案只适用于完整的支原体细胞。

因此，在样品浓缩之前，必须避免任何破坏细胞的程序(例如通过热失活)。可直接处理200µl体积的样品，无需样品

浓度的一步。

① 将最多1ml样品上清液转移到1.5 ml反应管中。

② ≥10,000 x g离心15分钟(或≥13,000 x g离心6分钟)，使支原体颗粒成球。

③丢弃上清，用200µl Tris缓冲液(10 mM Tris- hcl, pH 8.4)重悬小球。

④使样品短暂旋转，然后立即进行样品稳定或DNA提取。

2、样品预稳定

（可根据实验需求选做）

细胞培养样品可能含有高浓度的DNA酶，即使在低温下也会降解支原体DNA。因此，我们建议采取以下步骤来稳定样品。如果在样品采集后立即进行DNA提取，则可以省略此步骤。

①从细胞培养液中取500µl上清转移到1.5 ml反应管中。把盖子盖紧。

②样品在95°C下孵育10分钟。

③以最大转速离心样品。速度短暂(15秒)，以颗粒细胞碎片。

④用样本提取DNA。在+2至+8°C或≤- 18°C的条件下长期保存样品，最长可保存6天。

3.DNA提取

大量证据表明，需要提取DNA才能达到比较高的灵敏度。许多DNA提取方法建立了各种各样的样品材料。然而，DNA提取方法必须与支原体和样品特异性相适应。对于EP和jp兼容的测试，DNA提取方法必须与PCR试剂盒结合进行测试。我们推荐Venor®GeM样品制备试剂盒(Cat：56 - 1010 / -1050/-1200)。该DNA提取试剂盒为此目的进行了广泛的测试。

一、准备PCR试剂

二、配制反应体系

普通细胞培养物

14.5 µl 水

2.5 µl 10×缓冲液

2.5 µl 引物/dNTP溶液

2.5 µl 内控

1.0 µl Taq酶 (1 unit)

每个PCR管移液23µl，丢弃剩余材料，使反应混合物涡旋5秒。

生物药或需遵循药典的样本

体系包含：

6.5 µl 水

2.5 µl 10×缓冲液

2.5 µl 引物/dNTP溶液

2.5 µl 内控 

1.0 µl Taq酶 (1 unit)

每个PCR管移液23µl，丢弃剩余材料，使反应混合物涡旋5秒。

三、加样

在配制好的反应体系中，分别加入阴性(无模板对照，NTC)对照、阳性对照、样品.

普通细胞培养物

• 阴性对照:加入2µl PCR级水(白色帽)。

• 样品:加入细胞培养上清或DNA提取液2µl。

• 阳性对照:加入2µl阳性对照DNA(绿色帽)。

• 关闭并涡旋所有PCR管，加载PCR仪并启动程序。

  
  

生物药或需遵循药典的样本

• 阴性对照:加入10µl PCR级水(白色帽)。

• 样品:加入DNA提取液10µl。

• 阳性对照:加入2µl阳性对照DNA(绿色帽)。

• 关闭并涡旋所有PCR管，加载PCR仪并启动程序。

四、开始扩增

将PCR管放入PCR仪并盖紧盖子，按照下图中的程序设置PCR仪，并开始程序。

五、琼脂糖凝胶电泳与结果分析

注意事项

⇒由于细胞碎片对PCR反应的负面影响，不能直接使用细胞团进行检测。细胞颗粒、胎牛血清(FCS> 5%)、疫苗、冷冻储存和石蜡包埋样品，在PCR前需要提取DNA。Venor®GeM经典试剂盒使用Venor®GeM样品制备试剂盒(Cat.56-1010/-1050/-1200)进行DNA提取。提取的DNA可在+2至+8°C下保存6天。长期储存必须在≤- 18°C。

⇒培养基中的青霉素或链霉素不抑制支原体，也不影响试验的敏感性。

⇒不建议将不同批号的试剂混合使用。试剂盒中的试剂如果超过保质期，也不建议使用。

⇒严格遵守实验操作规范。任何偏差都可能影响测试方法和结果。

⇒如果提取DNA，使用新鲜的细胞培养基或洗脱缓冲液作为阴性对照。

⇒在阴性对照和测试反应后准备阳性对照，避免交叉污染。PCR抑制可能是由样品基质引起的，或者在提取DNA的情况下，由洗脱缓冲液引起的。因此，我们推荐Venor®GeM样品制备试剂盒。任何其他DNA提取试剂盒都需要验证。