细胞支原体去除试剂——Mynox Gold使用指南

细胞培养物被支原体污染是经常发生的。在细胞培养物中消除、灭活或抑制支原体常用的方法是用抗生素处理。

然而，一般来说，单靠抗生素处理不能长久地消除支原体。此外，抗生素的细胞毒性可在真核细胞中引起不良反应，并可能促进耐药支原体菌株的发展。因此推荐使用，针对支原体起作用的支原体清除试剂——Mynox®  Gold。

产品名称：珍贵细胞株 清除支原体试剂

英文：Mynox® Gold Mycoplasma Elimination Reagent

品牌：Minerva-Biolabs®    

货号：10-0201

规格：2套/盒    

Mynox® Gold代表了经典Mynox®试剂的进一步发展，将抗生素和生物试剂与生物物理作用模式相结合，从而尽可能杀灭细胞中的支原体。

与其他细菌细胞相比，支原体没有细胞壁，但被质膜包围。Mynox® Gold中含有的生物试剂可整合到支原体膜中，并损害其完整性。由于这种联合配方，生物试剂和抗生素的有效剂量可以降低到更低的细胞毒性，同时仍然可靠和明确地消除支原体。

该试剂的生物物理作用模式将耐药菌株的发展风险降至可忽略不计的水平。

Mynox® Gold的一次应用包括4个小瓶：1个『治疗液』和2个『巩固液』，每种成分都是无菌的即用型溶液。『治疗液』破坏大部分支原体颗粒，而『巩固液』不可逆转地破坏所有剩余颗粒，将支原体从处理过的细胞培养物中消除。两种处理方法对培养的细胞都是无害的。

以下方法步骤是为需要标准培养基的典型细胞培养而设计的，可用于贴壁和悬浮细胞系，个别情况下可能需要对这些程序进行修改和优化。

一、『治疗液』混合物的制备

1.将4.5 ml含5% v/v FCS的标准细胞培养基移入15ml无菌锥形离心管中，并加入500µl Mynox®Gold Starter Treatment(橙红色盖的小瓶)。

2.旋涡Mynox® Gold/培养基混合物。

3.将Mynox® Gold培养基混合物(5ml)转移到无菌25平方厘米细胞培养瓶或无菌6cm培养皿中。

二、制备细胞

1.像往常一样传代细胞，用胰蛋白酶分离细胞团，获得单个细胞。

2.将含有5% (v/v) FCS的5ml细胞培养基中的10^4 - 10^5个单细胞转移到Mynox®Gold培养基混合物中。处理混合物的总容积为10 ml，最终FCS浓度为5% (v/v)。

3.轻轻地前后左右摇动烧瓶或培养皿，以避免细胞分布不均匀。像往常一样孵育细胞，然后进行Mynox® Gold巩固处理。

三、巩固处理

1.培养细胞至80 - 90%的融合度。

2.以常规方式传代。向含新鲜培养基的9.5 ml传代细胞中，加入500µl Mynox®Gold『巩固液』试剂(白色透明帽的小瓶)。调整FCS浓度。不再需要添加5% (v/v)的FCS。

3.重复Mynox® Gold巩固处理2次以上。在第3次治疗后(从起始处理开始共4代)，支原体消除程序完成。

四、支原体检测

1. Mynox® gold处理的细胞培养物和病毒库需要在不含支原体抗生素的情况下再培养4代，然后才能检测支原体是否再次出现。对于高灵敏度的支原体污染检测，我们推荐使用基于PCR的Venor®GeM支原体检测试剂盒

2.  定期重复PCR支原体检测试验，以确保维持无支原体的细胞培养。

👉由于Mynox®Gold的作用模式是基于其与支原体膜的物理络合作用，因此有效的治疗需要试剂与支原体颗粒直接接触。应避免治疗细胞团。支原体可以积聚在细胞间隙以及细胞膜的口袋和缝隙中，从而逃避与药物的接触。在对细胞进行消化处理时，需要在显微镜下检查，确保对单个细胞的处理。如有必要，增加胰蛋白酶处理的持续时间或通过仔细上下移液机械分解细胞团。

👉用于处理的细胞总数不应超过10^5个细胞(每个25平方厘米的细胞培养瓶或6厘米的培养皿)。这保证了低支原体负荷。

👉向『治疗液』中添加细胞时，应将移液管直接插入治疗混合物中，以避免气溶胶。注意不要用吸管头接触烧瓶内壁或培养皿内壁。

👉支原体去除处理后，不应直接使用基于PCR的检测方法。Mynox® Gold溶解支原体颗粒，随后将支原体DNA释放到培养基中。然后可以通过PCR检测到游离DNA，导致假阳性结果。

👉Mynox® Gold的效果，受反应混合物中脂质和蛋白质浓度的影响，例如，培养基补充剂的成分，如胎牛血清(FCS)。这些成分竞争性地结合Mynox® Gold中所含的生物试剂，并防止其与支原体膜结合。因此，我们建议，在细胞培养基中使用5% v/v FCS进行。由于血清蛋白和脂质成分的抑制作用，目前还没有针对高蛋白和脂质浓度生物制剂的治疗方案。

👉细胞培养基的类型不影响处理的效率。抗生素，特别是在需要选择的情况下，可以在治疗混合物中使用。