qPCR技术如何在『支原体检测』中大显神通？

无论是欧洲药典、日本药典、还是中国药典，均对细胞相关的临床项目有明确的支原体检测指标的要求。药典中还指出，核酸法经过方法学验证后，可替代传统的培养法与指示细胞法进行检测。

PART.01

qPCR检测支原体的技术原理

通过扩增高度保守的rRNA操纵子，或者更准确地说，扩增支原体基因组中的16S rRNA编码区，可以特异性地检测支原体。在FAM通道检测支原体特异性扩增片段。在HEX通道检测内部扩增对照的扩增。它能特异性检测所有导致细胞污染的柔膜体物种。真核DNA不会被扩增。通过内部对照，可检测PCR抑制剂的存在或不正确的DNA提取引起的假阴性结果。

样本通常为细胞培养上清液，如检测其他组织或细胞样本，需要对样本进行额外的处理，例如蛋白酶消化等过程。检测程序通常可在3小时内完成。

PART.02

qPCR用于支原体检测的优势

快速简便

与动辄30天起步的传统培养法相比，qPCR技术的反应时间相对较短，通常在几小时内就可以完成，大大缩短了用于检测对的时间成本。

灵敏度高

qPCR技术可以在非常低的病原体浓度下进行检测，这种高灵敏度使得qPCR能够有效地检测细胞培养体系、实验或生产流程中，是否发生支原体污染，即使在污染的早期阶段，也能够得到准确的结果。

并且配合灵敏度标准品，进行灵敏度的验证，进一步完善方法学验证的流程。

以德国Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP为例，检测限可达到≤10CFU/ml。

特异性强

qPCR技术可以使用特异性引物和探针来选择性地扩增目标支原体的DNA序列。通过设计引物和探针与目标序列高度匹配，可以避免非特异性扩增产物的产生，从而提高检测的特异性。

以德国Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP为例，一次检测即可涵盖所有常见易感染细胞的支原体物种（包括欧洲药典规定的9种支原体）。与细菌和真核DNA无交叉反应。

定量能力

与传统的PCR技术相比，qPCR可以提供定量信息。通过利用荧光探针或DNA染料，可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，从而得到目标序列的定量结果。这种定量能力使得qPCR技术在支原体载量的测定和污染进程的监测中非常有用。

PART.03

支原体检测试剂盒

德国MB公司生产的支原体qPCR检测试剂盒（均为探针法检测）：Venor Gem qEP，有以下优点：

①遵循欧洲药典流程要求

②高特异性。一次检测即可涵盖了所有可能感染细胞的支原体物种（涵盖欧洲药典规定的9种支原体），根据序列一致性，至少可以检测到107种支原体物种。操作简单，易于观察（使用MB的试剂盒，多种支原体物种均为阳性，其他微生物或真核细胞均为阴性，无交叉反应）。

③高灵敏度。MB公司的支原体qPCR检测试剂盒经典法检测限可达到≤10CFU/ml。

④各类标准品配套齐全

10CFU/100CFU的敏感度测试的标准品，便于方法学验证。

支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。

支原体绝对定量标准品，便于最后定量检测。