用qPCR检测支原体，这3个关键点要注意！

更新时间：2023-05-01 | 点击率：454

实时定量聚合酶链式反应（qPCR）是一种高灵敏度、高精确度的分子生物学技术，用于检测和量化DNA或RNA的数量。该项技术已经广泛用于生物相关行业的检测项目中，其中就包括支原体检测。

我们都知道，支原体污染对于细胞相关的临床项目危害巨大，支原体检测是项目申报的必要环节。实现检测的高灵敏度、高特异性，并尽可能缩短实验时间，是非常有意义的。

药典方法中，培养法和指示细胞法都各有缺点，而qPCR方法兼顾了二者的优点，受到众多从业人员的青睐。那么在实验过程中，有哪些注意事项？本期内容，以德国Minerva Biolabs公司生产的Venor Gem qEP为例，盘点qPCR检测支原体的关键点。

Venor Gem qEP试剂盒能检测多种支原体、灵敏度高、遵循欧洲药典流程要求。

Part.01 样品处理

一般来说，该试剂盒适用于细胞、细胞培养上清等物质的支原体检测。

当细胞长至80%-90%时，收集样品。此时可对样品进行95℃的孵育处理。

需要注意的是：细胞培养产物中可能存在PCR抑制物质，例如：细胞颗粒、较大的样品体积或其他生物材料（疫苗、石蜡包埋样品等）、胎牛血清含量＞5%等情况，需要在进行PCR之前，对样品进行DNA提取处理，以尽可能减轻无关因素对实验结果的干扰。

这里推荐试用配套的德国MB支原体提取试剂盒：

有小伙伴可能会产生疑问：培养基中的青霉素或者链霉素，会不会对实验结果产生影响？

就目前有记录的研究结果而言，没有发现常用的“双抗"会对检测的灵敏度等造成影响。

Part.02 反应体系建立

在进行支原体qPCR检测时，需要设置合适的反应体系和条件。反应体系包括Mix、样品DNA、缓冲液、内控等组分。反应条件包括扩增温度、时间、周期数和荧光信号阈值等参数。

需要注意的是：需严格按照使用说明中的参数进行设置。随意更改数值可能会影响检测结果的准确性。

Part.03 结果解释

FAM通道：检测支原体荧光信号。

HEX通道：检测内控对照荧光信号。

需要注意的是：支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。

定量需基于Ct值和DNA标准曲线。

Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。