『支原体检测方法』到底应该怎样选？

生物医药与支原体检测

在疫苗、生物药、细胞治疗领域等领域，支原体检测发挥着重要作用，该项检测是检查药物是否遭受外源因子污染的有效手段，是保证产品质量的重要质控途径。

我国药典中有提到，在一些领域需要进行支原体检测。包括主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、检定细胞、病毒种子批和病毒收获液、细胞培养相关材料如培养基、胰酶、临床治疗用干细胞和免疫细胞、新生牛血清以及杂交瘤细胞等。

常见的支原体检测方法有以下几种：

• 培养法

• 指示细胞法

• 核酸法

• ELISA法

琳琅满目的检测方法这么多，究竟该怎么选？本期内容盘点了几种常见的支原体检测方法，希望能帮助小伙伴们选择适合自己的方法。

方法一：分离培养法

方法

简单来讲，就是从样品细胞培养体系中取样，接种到适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上生长，最终形成明显可见的特征性菌落。

优点

操作规范的情况下，这种方法很少会出现假阴性结果，检测精确度很高，因此被誉为支原体检测金标准。

该方法也是《美国药典》中认可的支原体检测方法之一。

缺点

检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。

还有一点就是，培养法无法对曾经感染过的样品做出判断。

另一方面，尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如支原体M. Hyorhinis。因此，该方法能鉴定的支原体种类有限，成为它的另一个缺点。

方法二：指示细胞法

方法

将供试品接种于指示细胞（无污染标准化Vero 细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞，供试品应对该细胞生长无影响）中培养后，用特异荧光染料进行染色，支原体中的核酸也可以被着色。

因此，如果待检测细胞中含有支原体，那么就会导致指示细胞被感染，进而在细胞膜或培养基等处发现蓝色荧光（支原体附着在细胞膜上，也有可能游离在细胞培养基中）。

优点

适用于一些不易培养的支原体，如猪鼻支原体，分离培养法对该支原体检测并不可靠，但可用DNA染色法准确地检测出来。属于《美国药典》中认可的方法。

缺点

时间较长，从Vero细胞复苏、传代，再到收集上清后再次培养，有时甚至需要十几天时间

存在假阳性和假阴性的可能：如一些死亡细胞释放出来的DNA会被染成蓝色，出现假阳性；或是由于荧光过若而出现假阴性使结果出现偏差，因此使用这个方法需要一定的经验。

方法三：核酸法

方法

通过对样品中可能存在的支原体DNA进行扩增并检测，来判断样品是否被支原体污染。常用的核酸法主要有常规PCR法和荧光定量PCR法（qPCR），德国MB均有针对这两种方法设计的高效试剂盒。

优点

目前使用较为广泛，拥有检测速度快、高特异性、高灵敏度等特点，还可以选配支原体和细菌DNA、支原体绝对定量标准品，来进行特异性验证、定量检测。

《美国药典》中指出，核酸法经过方法学验证，可替代培养法以及指示细胞法这两种经典方法。

缺点

qPCR的检测试剂盒成本相对较高。

总结

在选择支原体检测方法时，应从实际的应用场景出发。

如果只是想判断样品是否被支原体污染，无需出具报告等专业说明，使用德国MB的常规PCR检测试剂盒即可。

如果是疫苗、生物药等产品的上市前检测，需要出具专业的报告，则需要用到德国MB的qPCR支原体检测试剂盒，同时配套使用标准品，完成方法学验证，为了提高准确性和灵敏度，建议配合支原体DNA提取试剂盒一起使用。