都是qPCR，结果为何差距这么大？

简单来说，应用该原理的荧光探针，是由荧光基团+DNA寡核苷酸+淬灭基团构成。

探针由5’端标记有荧光报告基团、目标基因特异性结合的寡核苷酸序列以及3’端标记有淬灭基团以及与组成。

自然状态下，探针完整，荧光报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，仪器不会检测到荧光信号。

当存在目标序列时，目标DNA变性解链，荧光探针特异性结合到目标基因处。引物也结合在目标基因上，Taq酶又名DNA聚合酶，能将核苷酸添加到引物中，引物开始延伸。

Taq酶还具有5’-3’核酸外切酶活性。当引物延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，进而被qPCR仪检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的DNA的浓度成正比。

荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线"，通过荧光信号的强度反映出体系中双链DNA的浓度。

荧光探针有许多不同种类，以应对不同的实验需求，该方法特异性高，已经被广泛地应用于基因检测、病原体和病毒检测、疾病耐药基因筛查等领域。

该方法用到一种非特异性双链DNA荧光染料，被激发后，显示为绿色荧光。

该染料以一种非特异性方式，与双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域相结合。游离的染料荧光信号微弱，在进行qPCR扩增生成dsDNA时，染料逐渐与dsDNA结合，荧光信号被很大程度放大，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比。

荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线"，通过荧光信号的强度反映出体系中dsDNA的浓度。