细胞冻存『扫雷指南』，这些关键点必看！

细胞冻存

细胞冻存是细胞实验中的一个常规步骤，是细胞保存的重要方法之一。将细胞低温保存在-196℃液氮中，使细胞暂时脱离生长状态而进入休眠阶段，以便日后复苏重新培养扩增。

细胞冻存方法

细胞冻存实验，在往期文章中也有提到

保姆级细胞冻存方法

看似简单的实验，仍有一些关键点需要格外留意，切莫踩到“雷区"，造成“实验大翻车"。

冻存操作前：

选择长势良好、存活率高，且生长密度在80%—90%的细胞进行冻存。

需对细胞进行杂质检测：是否有杂细胞或者支原体等杂质。

这里推荐使用MB支原体常规法PCR检测试剂盒，非定量检测，常规PCR即可满足需求，方便快捷，灵敏度高。

所用冻存试剂DMSO应为分析级，避光储存。

冻存前一日，对需保存的细胞进行换液处理。

冻存操作

配制冻存培养基（常规含量）：DMSO含量5-10%，血清含量20%左右。

用冻存培养基将离心后的细胞进行重悬。

分装至无菌冻存管中。

梯度降温：

4℃ 10 分钟

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-20℃ 30 分钟

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-80℃ 16～18 小时

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液氮

或将装有细胞的冻存管，置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱中，一天后转移至液氮中。

液氮的液相储存与气相储存

一般认为：-196℃的液氮，对于需要长期保存的细胞而言，是一比较合适的环境。因此，我们会将装有细胞的冻存管，放入专用的方形冻存盒中，再装进液氮罐配套的提篮提篮中，浸入液氮的液相中进行保存。

但在液相中长期储存，容易面临以下问题：

如果冻存管在罐内密封不严，则会引起液氮渗入管内，灌满整个样品管，造成样品的污染。不仅如此，在取出冻存管的时候，液氮沸腾气化使管内气压升高，发生炸裂，容易伤到实验人员。

因此，有人提出，可以将细胞置于液氮的气相中进行储存。

液氮罐内温度较比液相储存高，一般在-135℃至-190℃，对于细胞储存而言，该温度也符合要求，但在实际操作过程中，也存在一定弊端：

与液相液氮罐相比，气相液氮罐，在相同体积的液氮中保存时间更短，需对液氮罐内的温度进行监控，及时补充液氮来维持罐内温度。

所以，应根据实验环境、实验条件等情况，合理选择液相储存或是气相储存。在正确操作的前提下，这两者都能达到比较好的冻存效果