支原体检测试剂盒qPCR Kit (经典法)的操作步骤

支原体qPCR法介绍：

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点：

①灵敏度高、特异性强。

②时间短，2-3小时出结果

③检测结果可定量

④操作简便

缺点：

①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。

操作步骤

第1步：样本处理

a.细胞培养上清

b. 生物药或需遵循药典的样本

说明：①样品基质可能会影响检测的灵敏度。收集和筛选更高的样品量可提高测定灵敏度。

②细胞培养物样本含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原DNA，影响检测灵敏度。

建议：样本做DNA抽提处理，实现最高灵敏度。

推荐：德国MB公司生产的专用支原体DNA提取试剂盒

Venor® Gem Sample Preparation Kit

该DNA抽提试剂盒已经过广泛验证。

第2步：试剂制备

a.冻干粉溶解

b. 反应体系制备

b1) 样品为细胞上清筛查——反应体系制备

b2) 样品为生物药——反应体系制备

第3步：启动荧光定量PCR仪

第4步：结果判别

FAM通道：检测支原体荧光信号。HEX通道：检测内控对照荧光信号。

支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。

支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。

定量需基于Ct值和DNA标准曲线。

Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果