带您了解RT-PCR引物/探针

一、产品用途：

RT-PCR引物/探针（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性检测和分析新guan病毒RNA。它仅用于研究，不用于临床诊断。

二、产品描述：

1.该产品包括三个小管：

①橙盖：  Mix（冻干粉），1管。

此管为新guan病毒引物/探针，可特异性扩增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依赖性RNA聚合酶基因），而其他冠状病毒RNA不会被检测到【1】【2】。（该引物/探针依据WHO诊断参考实验室公布的新guan病毒引物/探针序列而设计【1】。更多详情可访问

如要检测其他冠状病毒，推荐MB公司提供的其他冠状病毒引物/探针，品名：CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix)，货号：271-1100。

②绿盖： Positive Control RNA（阳性对照RNA，冻干粉），1管。

此阳性对照RNA为一段合成的RNA序列（序列来自武汉的病毒株）。

③白盖： PCR Grade Water（液体），1管。

2.使用前，①橙盖和②绿盖先用PCR级水（③白盖）复溶，并分装，避免反复冻融。

3.该引物/探针应与MB公司提供的【RNA病毒检测试剂盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix,

货号192-0025/-0100/-0250）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反应检测。

4.检测样本需为抽提过的RNA样本。

5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道检测，扩增的人RNA酶P基因（过程对照）用ROX™通道检测，用以评估样本的制备质量。

三、产品特点：

1.靶点特别。依据WHO国际标准，此引物探针为新guan病毒RdRp基因，而非市面上常见的ORF1ab和N基因或E基因。

2.阳性对照RNA为一段合成的RNA序列（序列来自武汉的病毒株）。

3.主要组分为冻干粉，4℃保存，储存运输方便，性能稳定。

4.适用于科研中，各种来源的RNA样本，包括拭子、活检组织、哺乳动物细胞和细菌等。

四、需用户自己准备的试剂耗材和仪器：

1.RNA病毒检测试剂盒（RT-qPCR法）（英文名：ConviFlex™ RT-Taq Mix，货号192-0025/-0100/-0250）

2.荧光定量PCR仪（qPCR仪）

3.无DNase和RNase的qPCR反应管

4.离心机

5.移液器及带滤芯吸头（不含DNase和RNase）

6.用户自己提取的RNA或现成的RNA样品。（抽提过程建议使用商品化的RNA提取试剂盒完成，如MB厂家的：

【病毒RNA提取试剂盒】（ExtractNow™ Virus RNA Kit，货号611-1010/-1050/-1250）

或【病毒RNA拭子提取试剂盒】（ExtractNow™ Virus RNA Swab Kit，货号611-2250）。

五、操作注意事项：

该引物/探针应仅由经过培训的实验室人员使用。

始终穿上合适的防护服和戴一次性手套。

根据样品类型，应谨慎处理所有样品。请遵循WHO推荐的方法处理样本。

该试剂盒不含有害物质。 残余物可以根据当地法规丢弃。

六、操作步骤：

步骤1. 试剂制备

①橙盖Mix引物探针冻干粉，最大速离心5秒钟，加入525lPCR级水（白盖），室温静置5分钟后，涡旋并离心5秒钟，分装，待用或-18℃保存。

②绿盖Positive Control RNA阳性对照冻干粉，最大速离心5秒钟，加入105lPCR级水（白盖），室温静置5分钟后，涡旋并离心5秒钟，分装，待用或-18℃保存。

步骤2. RT-qPCR引物/探针mix制备（20μl反应体积）

（1）1个反应需要加入：酶预混液 （自备的红盖预混液）10l ，

橙盖（复溶的Mix引物/探针）5l

（红盖预混液 来自MB公司的【RNA病毒检测试剂盒】（RT-qPCR法），

英文名：ConviFlexRT-Taq Mix, 货号192-0025/-0100/-0250，需单独购买）

（2）将以上引物/探针mix涡旋混匀，并离心5秒钟。

（3）每个PCR管中加入15μl上述引物/探针mix和5μl样本（抽提后的RNA），

或5μl RNA提取试剂盒中的洗脱缓冲液，作为阴性对照，或5μl PCR级水作为无模板对照，或5μl阳性对照RNA。

（4）紧扣PCR管，然后短暂离心。

（5）将PCR管放置qPCR仪上，紧上顶盖。

步骤3. 设置qPCR程序

1个循环： 55 ℃，10分钟

1个循环： 94 ℃，3 分钟

45个循环：94 ℃，15秒

58℃，30秒

步骤4. 启动程序

七、使用注意事项：

1.使用前应认真阅读说明书。

2.来自不同批次的试剂不能混合。

3.试剂盒内的试剂应始终作为一个整体溶解分装。

4.试剂盒应在效期内使用。

5.每次PCR至少应设置一个阳性对照。每次PCR至少应设置一个阴性对照和/或一个无模板对照。如果实验者自己抽提RNA，则可使用洗脱缓冲液作为阴性对照。对照必须与待测样品的处理方式相同。您也可能需要其他实验室提供的对照品，例如含高、中、低不同浓度的RNA样品。使用对照，对于确认结果的可靠性或用于排除故障非常有意义。

6.建议在无RNA和DNA污染的条件下进行RT-PCR，以避免操作过程中DNA或非特异RNA的交叉污染。（MB公司推荐使用PCR污染祛除喷雾，英文名：PCR Clean™，货号15-2025，预先清洁实验环境。）

7.尽量减少RNA样品的冻融次数，同时避免RNA酶污染，以减少RNA降解的风险。（RNA降解会极大地限制了RT-qPCR反应的性能）。请确保高质量的完整RNA用于检测。

8.样本制备过程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干扰也会降低qPCR的准确性。