贴壁细胞如何高效传代？

细胞培养的本质是细胞克隆技术。原理就是尽可能给细胞提供类似于体内的环境，在无菌条件下，给予适当的温度和酸碱度以及细胞生长繁殖所必要的营养条件，使其能在体外维持正常的生长繁殖，并保持其结构和功能的技术。

细胞培养技术的应用十分广泛，基础医学研究，抗体制备，新药筛选，基因工程等等都需要用到细胞培养技术。

贴壁细胞如何高效传代？

贴壁生长的细胞，在培养瓶或者培养皿长至单层铺满的状态后后，空间已基本上饱和，细胞生长、增殖受阻，为使其继续扩增或生长，需要进行传代（再培养）处理。同时，传代培养也可用于细胞种的保存。不仅如此，各种细胞实验也是以高效的细胞传代为基础的。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞则需经消化等处理后才能分瓶。

一般使用胰蛋白酶，将贴壁细胞消化成成单个细胞，也可加入EDTA提高消化能力（EDTA 是一种二价离子的螯合剂，能抑制细胞膜上的Ca2+和Mg2+）。

常用的细胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA。

实验时，先用吸去细胞培养上清，用PBS清洗细胞，弃掉洗涤液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(根据培养皿的大小不同，一般2-5ml消化液即可，以刚好铺满整个皿底为原则)，观察细胞直到细胞变圆脱离瓶壁，此过程一般需要3-5分钟，为了避免细胞成团，消化细胞的过程中不要拍打细胞瓶。对于特别难消化的细胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把细胞置于37°C 促进消化，细胞脱离瓶壁后，立刻加入含有血清的*培养基中止消化。

800-1000rpm，离心5分钟，然后弃去中止用的培养基，加入适合的新的培养基轻轻混匀细胞，移入到新的培养瓶。传代的比例视细胞类型而定。胰蛋白酶会对某些细胞的细胞膜产生损伤，对于这种类型的细胞，可用细胞刮轻轻刮下细胞，加入适量的培养基，轻轻吹打混匀细胞，然后进行传代培养。

WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：

1、牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家，并应具备适当的监测系统。

2、有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

3、证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

4、血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。

5、无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。

6、对细胞有良好的支持繁殖作用。

我国对牛血清的质量中提出比较严格的标准要求：

包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。一款来自澳洲的Ausbian®胎牛血清在市场上颇受欢迎。它具有精选内毒素极低、产量充足的血清批次，满足干细胞、基因敲除、原代培养、细胞典藏、长期传代等各类细胞的培养要求；澳洲血源，完整的检测报告及灭病毒服务，为各类临床相关项目的申报提供完整支持等特点。