珍贵细胞被支原体污染了怎么办？

一般细胞遇到支原体污染时，应立即丢弃，以避免成为污染源。但对于非常珍贵的细胞、不易获得的生物样本或细胞种子，遇到支原体污染，希望挽救而不能丢弃时，应怎么办呢？

这里向您推荐支原体*清除法——使用德国MB公司生产的Mynox® Gold，直接杀除支原体并在细胞培养三代过程中巩固防护，即可*清除细胞中的支原体。

支原体污染祛除剂——Mynox® Gold（细胞保种用）

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产品信息

（生产商：德国MB公司）

每套Mynox® Gold支原体祛除剂

包括：

1管 首ci治疗液Mynox®

3管 巩固防护液

推荐使用范围：研究用

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产品特点：　

1.支原体祛除有效率接近100%。

2. 适合所有细胞类型， 包括永生细胞（如Vero, BHK21, GBK, ML, Hep2, CRFK, H9, Molt4, MT-4, Jurkat）、原代细胞和干细胞。

3. 无细胞毒性。用Mynox® Gold处理细胞时，大多数类型细胞没有形态变化。

4. 低耐药风险。主要采用生物物理学方法直接清除支原体。

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工作原理

【首ci治疗液Mynox®】是一款直接杀除支原体的试剂。

它来自枯草杆菌提取物，可特异性地与支原体膜结合，改变支原体膜通透性，从而使支原体在2-3小时内破溃死亡（下图）。

【巩固防护液】加入培养基，后续培养一个月，将会*清除细胞中的支原体污染，确切有效（3管「巩固防护液」可传3代）。

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使用方法

实验所需耗材：25cm2细胞培养瓶或60 mm 培养皿

支原体消除结果评估：采用支原体检测试剂盒如Venor®GeM系列。

具体操作步骤如下（超净台内操作）：

01

制备“首ci治疗混合液"

1）吸量管吸取4.5ml含5%胎牛血清的细胞培养基，加入到无菌的15ml离心管中。再加入500 µl Mynox ® Gold首ci治疗液（橘黄色盖）。

2）将15ml离心管内的培养基和Mynox® Gold首ci治疗液混匀。

3）将15ml离心管内的混合液（5ml）转移至无菌的25cm2细胞培养瓶或60 mm 培养皿中。

02

加入细胞

按细胞正常传代来操作。对于贴壁细胞，使用胰酶将细胞解离打散。

1）注意：显微镜下观察，确保为单细胞悬液，无细胞成团。

2）吸量管吸取5ml单细胞悬液（含104–105细胞，细胞培养基含5%胎牛血清），加入到上述的“首ci治疗混合液"中。此时总体积为10ml。

注意：加入细胞时，吸头插入到液面下，以避免产生气溶胶。吸头不要触及培养瓶/皿的内壁。

3）轻轻摇晃培养瓶/皿，以避免细胞分布不均。将细胞转至孵箱正常培养。

03

主要治疗

1）细胞长至80~90%汇合。

2）细胞正常传代。取9.5ml已加新鲜培养基的细胞，加到无菌培养瓶或培养皿中。再加入500 µl Mynox® Gold巩固防护液（透明管盖）。调整胎牛血清浓度，不再将其浓度再保持在5%，可恢复正常浓度。

3）加入巩固防护液的细胞继续培养，再重复以上步骤2次（采用Mynox® Gold巩固防护液治疗2次）。第3次巩固防护液治疗后，支原体即*去除（细胞总共传了4代）

04

支原体残留的检测

支原体被Mynox®裂解后会释放DNA到培养基中，此时检测支原体会导致假阳性。应在正常培养四代后检测支原体。培养基更换和使用外源DNA酶可在1-2代内降低游离的支原体DNA。

建议采用高灵敏度的Venor® GeM支原体检测试剂盒检查支原体。

注意：

a) 做支原体清除时，一次治疗的细胞数不要超过105。

b) Mynox® Gold的支原体杀除活性受到反应混合液中的脂质和蛋白浓度的影响。在步骤1和步骤3中，与「首ci治疗液」配合使用的培养基，FBS浓度均为5%，不要浓度过高。从步骤5开始，与「巩固防护液」配合使用的培养基，其中FBS的浓度则恢复为原来正常使用的浓度。

c) Mynox® Gold通过和支原体膜直接接触而产生杀灭效应。应避免细胞成团，否则支原体可能躲在细胞间隙中，影响祛除率