干细胞标准培养方法是什么？

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞[1]。

干细胞被认为可以提供一种理想的生物学平台, 用于多方面的科学研究与临床应用, 如药物筛选平台的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等[2]。

干细胞研究离不开干细胞的培养。合格的干细胞培养的过程，包括促进其分裂增殖和维持其未分化状态。

基于以上两点要求，目前主流的标准培养方法为饲养层培养法：

即在有丝分裂失活的饲养层细胞 (FEEDER) 上培养干细胞。培养体系一般为高糖DMEM，添加适量的胎牛血清 (FCS) 及白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺等添加剂。

另外，为了避免外源性物质的干扰（如血清、病原等成分）[3]，又尝试及建立了其他培养基, 包括条件培养基 (CM) 、无饲养层、无血清、血清替代物 (SR) 非条件培养基等。

其中无血清培养基中添加了更多珍贵的细胞因子，而血清替代物培养基则采用人工/半人工合成分子替代物的形式，来替代血清，成本相较于普通胎牛血清*培养基而言，高出不少。

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饲养层培养法

目前认为，饲养层能够提供干细胞接触所必需的复杂蛋白分子。自1981年EVANS等人[4]用饲养层成功培养了mESC起，饲养层培养法便开始不断发展。实验过程，主要分为以下三步：配制饲养层细胞培养基、准备饲养层细胞、配制饲养单层细胞培养基、饲养单层制备、配制干细胞培养基、接种干细胞培养。

饲养层培养法却存在着不可避免的缺点：

1、 饲养层细胞生命期有限，不能在体外长期传代。在体外传代时间太长，其产生促增殖因子和抑制分化因子的能力会减弱甚至丧失。

2、 MEF细胞的染色体干扰：饲养层细胞会影响干细胞遗传物质。　

3、 丝lie霉素-C的影响：饲养层细胞需要用到丝lie霉素-C，该物质可能会影响干细胞的增殖。

4、 异种抗原及污染的影响：饲养层细胞作为异种抗原也会影响干细胞的健康，还有发生细胞间融、引入其他动物源性病原体，给临床移植治疗带来风险。

5、 所用试剂复杂，批次不可控：所用材料的批次之间的波动，限制了培养物之间的可重复性。

6、 实验周期长，培养基配制复杂：在基础培养基的基础上，添加例如白血病抑制因子（LIF）[6]这样的多功能细胞因子，但无论进口还是国产的产品，都不免有价格高昂的缺点。而自己配制，又会面临操作繁琐、易污染等问题。饲养层培养从培养饲养细胞开始，至少需要一周时间才能得到所需的干细胞，周期过长。

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无饲养层培养

无饲养层培养类似普通细胞培养，主要分为以下几个步骤：培养瓶预处理、配制培养基、消化/复苏干细胞、接种、培养。

相较于饲养层培养法，无饲养层培养法的优点显而易见：更加简便、节省时间；但缺点也十分明显：

1、 培养的细胞质量不稳定：由于自行配制的培养基，不可控因素较多，缺少营养细胞对的存在，干细胞生长状况也不稳定，直接影响实验结果。

2、 成本高昂：商品化的培养基，根据品质不同，价格也是从几百元到几千元不等，直接增加了干细胞的培养成本。

3、 需要不断对培养基进行调整，对实验人员有很高的要求：无饲养层培养法需要人为添加各种各样的细胞因子，不同的干细胞还需要进行细微的调整以适应不同的生长需求，因此培养难度更高，对技术人员的操作水平及经验有很高的要求