细胞培养实战

细胞培养的本质是细胞克隆技术。原理就是尽可能给细胞提供类似于体内的环境，在无菌条件下，给予适当的温度和酸碱度以及细胞生长繁殖所必要的营养条件，使其能在体外维持正常的生长繁殖，并保持其结构和功能的技术。

细胞培养技术的应用十分广泛，基础医学研究，抗体制备，新药筛选，基因工程等等都需要用到细胞培养技术。

但在日常的细胞实验中，实验者经常会遇到一些问题，今天我们就这些常见的问题给出相应的建议，希望对小伙伴们有所帮助。

贴壁细胞如何高效传代？

贴壁生长的细胞，在培养瓶或者培养皿长至单层铺满的状态后后，空间已基本上饱和，细胞生长、增殖受阻，为使其继续扩增或生长，需要进行传代（再培养）处理。同时，传代培养也可用于细胞种的保存。不仅如此，各种细胞实验也是以高效的细胞传代为基础的。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞则需经消化等处理后才能分瓶。

一般使用胰蛋白酶，将贴壁细胞消化成成单个细胞，也可加入EDTA提高消化能力（EDTA 是一种二价离子的螯合剂，能抑制细胞膜上的Ca2+和Mg2+）。

常用的细胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA。

实验时，先用吸去细胞培养上清，用PBS清洗细胞，弃掉洗涤液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(根据培养皿的大小不同，一般2-5ml消化液即可，以刚好铺满整个皿底为原则)，观察细胞直到细胞变圆脱离瓶壁，此过程一般需要3-5分钟，为了避免细胞成团，消化细胞的过程中不要拍打细胞瓶。对于特别难消化的细胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把细胞置于37°C 促进消化，细胞脱离瓶壁后，立刻加入含有血清的*培养基中止消化。

800-1000rpm，离心5分钟，然后弃去中止用的培养基，加入适合的新的培养基轻轻混匀细胞，移入到新的培养瓶。传代的比例视细胞类型而定。胰蛋白酶会对某些细胞的细胞膜产生损伤，对于这种类型的细胞，可用细胞刮轻轻刮下细胞，加入适量的培养基，轻轻吹打混匀细胞，然后进行传代培养。

细胞传代的频率为多久？

贴壁型的细胞的汇合度约为100%的时候，需进行传代操作。

当细胞以克隆的形式生长时，汇合度则达不到100%。对于该类型的细胞，达到或者接近最大密度的时候，即观察不到细胞明显扩增时，就需要进行传代。

接触抑制型细胞需要在细胞长满之前传代，避免产生细胞长满后接触抑制后产生性状的改变。

悬浮型的细胞必须在细胞达到最大饱和密度之前传代，悬浮细胞传代时只需稀释至合适的密度，让细胞有充足的营养恢复到对数生长期。

如何处理肿瘤细胞株？

了解每株细胞可能产生的生物危害是很难的。

• 强烈推荐，所有的人类和其他灵长类生物的细胞在预防HIV和肝炎病毒的实验条件下操作；

• 所有的操作必须在生物安全柜中操作，遵守生物安全柜使用规范；

• 操作过程中产生的废液和废仪器都要经过清洗、酸处理等处理后才能丢弃。