注意这个关键点，让干细胞培养更轻松

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞 [1]。干细胞被认为可以提供一种理想的生物学平台, 用于多方面的科学研究与临床应用, 如药物筛选平台的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等 [2]。

干细胞研究离不开干细胞的培养。合格的干细胞培养的过程，包括促进其分裂增殖和维持其未分化状态。基于以上两点要求，目前主流的标准培养方法为饲养层培养法：即在有丝分裂失活的饲养层细胞 (FEEDER) 上培养干细胞。培养体系一般为高糖 DMEM，添加适量的胎牛血清 (FBS) 及白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺等添加剂。另外，为了避免外源性物质的干扰（如血清、病原等成分）[3]，又尝试及建立了其他培养基, 包括条件培养基 (CM) 、无饲养层、无血清、血清替代物 (SR) 非条件培养基等。其中无血清培养基中添加了更多珍贵的细胞因子，而血清替代物培养基则采用人工/半人工合成分子替代物的形式，来替代血清，成本相较于普通胎牛血清*培养基而言，高出不少。

一、饲养层培养法

目前认为，饲养层能够提供的干细胞接触所必须的复杂蛋白分子。自 1981 年 EVANS 等人 [4] 用饲养层成功培养了 mESC 起，饲养层培养法便开始不断发展。实验过程，主要分为以下三步：准备饲养层细胞、饲养单层制备、接种干细胞培养。

饲养层培养法却存在着不可避免的缺点：

• 1、饲养层细胞生命期有限，不能在体外长期传代。在体外传代时间太长，其产生促增殖因子和抑制分化因子的能力会减弱甚至丧失。

• 2、MEF 细胞的染色体干扰：饲养层细胞会影响干细胞遗传物质。 /3、丝裂mei素-C 的影响：饲养层细胞需要用到丝裂mei素-C，该物质可能会影响干细胞的增殖。

• 3、异种抗原及污染的影响：饲养层细胞作为异种抗原也会影响干细胞的健康，还有发生细胞间融、引入其他动物源性病原体，给临床移植治疗带来风险。

• 4、所用试剂复杂，批次不可控：所用材料的批次之间的波动，限制了培养物之间的可重复性。

• 5、实验周期长，培养基配制复杂：现在市场上有多种多样的干细胞培养基可供选择，大多数都是在基础培养基的基础上，添加例如白血病抑制因子（LIF）[6] 这样的多功能细胞因子，但无论进口还是国产的产品，都不免有价格高昂的缺点。而自己配制，又会面临操作繁琐、易污染等问题。而且饲养层培养发从培养饲养细胞开始，至少需要一周时间才能得到所需的干细胞，周期过长。

二、无饲养层培养

无饲养层培养类似普通细胞培养，主要分为以下几个步骤：培养瓶预处理、配制培养基、消化干细胞、接种、培养。

相较于饲养层培养法，无饲养层培养法的优点显而易见：更加简便、节省时间；但缺点也十分明显：

• 1、培养的细胞质量不稳定：由于自行配制的培养基，不可控因素较多，缺少营养细胞对的存在，干细胞生长状况也不稳定，直接影响实验结果。

• 2、成本高昂：商品化的培养基，根据品质不同，价格也是从几百元到几千元不等，直接增加了干细胞的培养成本。

• 3、需要不断对培养基进行调整，对实验人员有很高的要求：无饲养层培养法需要人为添加各种各样的细胞因子，不同的干细胞还需要进行细微的调整以适应不同的生长需求，因此培养难度更高，对技术人员的操作水平及经验有很高的要求

三、干细胞*培养基培养法

我们都知道，一直以来，干细胞的培养方法被饲养层培养法和无饲养层培养法所「统治「，近日，一项新技术——干细胞*培养基培养法问世！这项重大突破，兼顾了上述两种培养法的优点又巧妙规避了它们的致命缺点，大大降低了干细胞培养的技术门槛！

干细胞*培养基是一种真正意义上的全新干细胞培养技术！在含微量胎牛血清的基础培养基中，通过添加一种人永生化干细胞系的条件培养基混合组成。干细胞*培养基含有多种促进细胞增殖的生长因子，如表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、神经细胞生长因子（NGF）、肝细胞生长因子（HGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）及干细胞分化抑制因子等。因此，干细胞*培养基具有促进干细胞增殖、抑制干细胞分化及维持干细胞表型，增加干细胞的传代次数的作用，可广泛应用于人及动物的胚胎干细胞、间充质干细胞及各种组织来源的成体干细胞的培养。

由于人永生化干细胞系的使用，使得干细胞*培养基无需额外添加细胞因子或其他人工合成促生长成分，因此，相较于其他商品化的干细胞培养基、干细胞培养 Kit、无血清培养基、血清替代物 (SR) 非条件培养基等产品，用干细胞*培养基进行实验，成本相对更低，但效果却是更上一层楼。

纵观整个干细胞培养基市场，能同时满足以上几个条件的产品可以说是凤毛麟角。而 Ausbian 干细胞*培养基则是其中的优秀代表，让实验者可以轻松上手，各种干细胞培养都变得小菜一碟！

首先，Ausbian 干细胞*培养基拥有与众不同的技术，使得培养基本身就含有丰富的细胞因子，其中包含了所有含有促进干细胞生长和抑制干细胞分化的各种因子，因此能够有效维持干细胞的干性，抑制干细胞的分化。

其次，无需额外添加和二次配制，更省去了体现制备饲养层的复杂操作，根据细胞生长情况每 2-3 天更换一次培养基。这在无形之中减少了细胞培养的实验步骤，熟悉细胞实验的小伙伴应该都知道，实验步骤越简洁，不可控因素也就越少，实验出错的概率也会更低，因此，使用干细胞*培养，使实验更简单，可以大大缩短时间成本；培养的干细胞品质更稳定，对实验人员技术要求也更低，节省人力成本，轻轻松松让干细胞茁壮成长。

不仅如此，因为少了饲养细胞的干扰，也没有丝裂mei素-C 等物质的添加，所以用 Ausbian 干细胞*培养基能够收获纯度更高、遗传物质更稳定的干细胞。

在培养细胞有效性方面，许多科研人员对其进行了评估：培养间充质干细胞可以细胞传代次数 8-10 次、培养成体干细胞可以使细胞的增殖速率增加 300%，实验数据真实可靠。

1. 人成体干细胞（3 代）增殖实验：CCK8 分析

2. 人间充质干细胞（3 代）增殖实验：CCK8 分析

3. 细胞传代次数：

Ausbian 干细胞*培养基另外一项革命性的突破在于，可广泛应用于人及动物的胚胎干细胞、间充质干细胞及各种组织来源的成体干细胞的培养，省去了更换细胞时反复调试培养基的繁琐步骤，很高的普适性进一步降低了人力、物力以及时间成本。

说完有效性再来看看安全性。Ausbian 干细胞*培养基均经过严格的质量检验，无论是支原体还是衣原体检测均为阴性，无农药污染及重金属超标，同时还进行了放射性照射，确保培养基无任何病原体及病毒污染，确保内毒素极低，为干细胞提供一个安全健康的生长环境。

最后要说明的是，Ausbian 干细胞*培养基是我国的科学家自主研发的，其中制备的永生化人干细胞系为具有独te性，制备产品所使用的永生化人干细胞系国内同类产品，货源充足，供货稳定，供货周期短，保证干细胞生长过程中不会出现「断粮」的情况，让实验者更安心！

参考文献：

1. 裴雪涛．干细胞生物学：科学出版社，2003：4-15

2. 吴静,胡东,张荣波.胚胎干细胞培养方法研究进展[J].广东医学,2010,31(01):116-118.

3. J.A. Burdick, G. Vunjak-Novakovic Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation Tissue Eng. Part A, 15 (2009), pp. 205-219

4. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981 Jul 9;292(5819):154-6. doi: 10.1038/292154a0. PMID: 7242681.

5. 田小利，陈兰英，扈莱良. 1994.　转基因方法Ⅱ：胚胎干细胞法. 转基因动物原理、技术与应用. 吉林科技出版社， 26～32

Williams RL, Hilton DJ, Pease S. 1988. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature, 336: 684～687