支原体常规检测的几种方法

被广泛使用的方法

基于Venor®Gem qEP经典法试剂盒的qPCR检测法，目前使用较为广泛，拥有高特异性、高灵敏度等特点，还可以选配支原体和细菌DNA、支原体绝对定量标准品，来进行特异性验证、定量检测。

经典法pro版

基于Venor®Gem qOneStep一步法试剂盒的qPCR检测法，是经典法的升级版本，包含经典法所有优点。另外，内控已配置好，更加省时省力。

传统认为的金标准

分离培养法被认为是支原体检测的金标准，准确率比较高，但培养周期长，而且对于一些特定支原体无法培养。

操作步骤多但简单

DNA染色法检测支原体虽然操作步骤较多，包含指示细胞培养，上清液共培养、染色等多个过程，但并不复杂，对技术要求相对没有那么高。

今天我们就来介绍最后两种常见检测法

ELISA法和PCR法

废话不多说

我们直接上干货

ELISA法

首先我们先来简单了解一下ELISA：

酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。根据免疫吸附剂、酶联物、结合物这些试剂的来源、样本情况，检测具体条件，可以分为夹心法、竞争法、间接法等不同类型。

支原体检测过程中用到的ELISA，一般采用的是夹心法，针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。

先用纯化过的支原体抗体包被微孔板，制成固相抗体。

往微孔板中依次加入支原体（Mycoplasmal），再与 HRP（一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物）标记的支原体抗体结合，形成抗体 -抗原-酶标抗体复合物。

经过*洗涤后加底物 TMB显色。TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。

最后用酶标仪分析结果：

颜色的深浅和样品中的支原体（ Mycoplasmal）呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中支原体浓度。整个过程时间比较短，一般三四个小时就能出结果。

整个过程除取样外，还包括标准品稀释、加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止、结果分析，步骤比较多，且很多步骤都需要有一定经验的人操作才能保证准确性，因此对技术要求比较高。

另外，由于依赖抗体的特性，该方法能够检测的支原体种类比较有限，对于没有抗体的支原体，ELISA就无能为力了。

PCR法

常规PCR法：

根据支原体核糖体16s-23s rRNA的特异保守序列设计引物，对待检样本DNA进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出判断。

以Venor®Gem OneStep支原体常规PCR检测试剂盒为例，简单介绍一下实验流程。

样本处理

与qPCR类似

取适量待检测样品上清

95℃孵育10min

以对样品进行稳定化处理

试剂制备

离心➡按比例混合➡静置➡混匀

PCR体系建立

设置好阴性对照、阳性对照、重复孔

扣紧盖子混匀

启动PCR反应

根据使用说明设置好程序

电泳结果分析

191bp为内控对照条带，表明PCR反应正常。

当样本存在支原体污染时，由于内控对照与支原体DNA存在竞争，内控对照条带变弱（例如支原体DNA＞1000拷贝）。

阳性对照中支原体DNA＞10000拷贝，内控对照条带会*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的条带，此条带不影响检测结果。

如果待测样本对PCR产生抑制，则内控对照条带变弱（和阴性对照相比），此时应先进行DNA抽提（推荐使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原体DNA抽提试剂盒），然后再检测。

常规PCR的优点就是检测时间短：2-3小时即可出结果、灵敏度高、特异性强、操作简单。

缺点也很明显，用PCR检测已经进行过支原体灭活的样品时，由于支原体DNA依然存在，所以此时PCR结果仍为阳性，说明该样品曾经感染过支原体。

另外不同厂家的试剂盒差异比较大，需要谨慎选择。

ELISA法

至此，几种常规的检测方法都已经介绍给大家啦，给大家做了个小总结，供参考。有些单一的检测方法并不严谨，需要结合实验情况，联合使用多种方法进行检验，确保结果的可信度。

培养法是金标准，但是周期长，有些支原体还检测不到；

染色法普适性强，操作简单，但是对于支原体数量有要求，也容易有假阳性假阴性；

ELISA法耗时短，但是对操作人员要求比较高，需要获得相应抗体才可以进行试验；

常规PCR法，基本包含了上面所有的优点，但是不能分辨支原体的死活，用到的试剂盒也是良莠不齐；

qPCR法，涵盖上述所有优点，但是对实验人员有一定的经验要求，因此该方法目前也是十分常用的检测手段。

不同的是，“一步法"试剂盒中，直接将内控添加到预混液中，使用起来更加方便、节省时间。

下面我们就来详细介绍一下VenorGeM® OneStep支原体检测试剂盒。

使用方法

步骤

与经典法大致相同：

样品处理➡试剂制备➡体系建立➡启动PCR反应➡结果判定

样品处理：

取100μl左右的细胞上清液

95℃孵育后离心，取适量用于后续qPCR。

细胞培养样品易含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原体DNA。因而推荐进行样品稳定化处理。

试剂制备：

将缓冲液、预混液、阳性对照等试剂按照说明书要求，该离心的离心、该混合的混合，处理好后扣紧盖子备用。

PCR体系建立：

在PCR管中，根据需要，加入样品、阳性对照、新鲜培养基（阴性对照），并且设置好重复孔，盖好盖子，震荡混匀。

启动PCR反应：

按照所需参数，设置好PCR仪，启动程序（具体参数详见产品使用说明或是缔一生物网站，点击下方阅读原文即可）。