支原体CCU计数法与CFU定量法的比较

在制药和临床领域，支原体定量是采用CCU计数法。即用“颜色改变单位(CCU) ”对支原体进行定量。该方法主要是将支原体菌液10倍系列稀释，然后接种在含酚红的支原体肉汤培养基中，36°C±1°C 培养7～14天。使培养基变色的highest菌液稀释度定为1ccu/ml。

而在制药领域，用PCR/qPCR方法对产品进行支原体检查时，要求检测方法的检测限达到10CFU/ml。CFU即菌落形成单位，它代表着支原体在琼脂培养基上的菌落数量，这是另外一种定量法。

这两种定量法是否具有可比性？在2020年2月第4期的《卫生检验杂志》上，一篇名为《支原体菌落形成单位与颜色改变单位定量关系研究》的论文报告了两种方法比较的结果。

在该研究中，作者用A8培养基培养解脲支原体（ATCC 33175）48小时，用支原体培养基培养人型支原体（ATCC 23114）72小时，用SP4培养基培养肺炎支原体（ATCC 29342）6天，然而观察菌落的生长情况。同时，作者将菌株冻干粉复溶后进行梯度稀释，接种到相应肉汤中。为降低误差，作者对菌液采取了5倍系列稀释，而非10倍。当培养至肉汤颜色不再变化时，highest稀释倍数的菌液浓度即为1ccu/ml，然后根据稀释倍数回算出菌液原液的浓度。

在进行CFU计数时，作者发现，典型支原体菌落的直径是15mm~300mm。其中，人型支原体和肺炎支原体的菌落可以肉眼识别，而解脲支原体的菌落直径只有15mm~60mm，需要借助低倍显微镜才能看到并计数。

作者重复了10次，结果显示，对于这3株支原体，CCU计数较为稳定，CFU计数则存在一定的波动。对于解脲支原体，CCU与CFU二者的计量结果接近，无显著差异；而对于人型支原体和肺炎支原体，CFU计量数值略高于CCU计量数值，有显著差异。

由于支原体在肉汤生长比琼脂中要快，因此实际工作中CCU计数更为常见。作者认为，解脲支原体菌落较小，不容易计数，因而标准差较高。10倍稀释对CCU计量的结果会造成一定误差，因为实验中培养基变色的highest稀释度往往并不是能够变色的highest稀释度。降低稀释倍数会减少误差，但是会增加工作量。

在该实验中，作者给出了三个菌株10次试验的全部数据，因而可对CCU计数与CFU定量的结果进行比较，明确二者之间的关系。

目前，在支原体检查中，越来越多的药厂采用PCR或qPCR方法。但该方法用于放行检测时，需要进行方法验证，保证适用性。这是，常用到10CFU^TM支原体灵敏度标准品。

对于制药领域的支原体检查，欧洲药典规定，以PCR为代表的核酸扩增技术如果要替代培养法，其检测限需至少达到10CFU/ml。

德国Minerva Biolabs公司（简称MB）提供有欧洲药典规定的9种支原体的10CFU^TM灵敏度标准品，经过jign准标定，可用于PCR/qPCR的灵敏度验证。

菌株均来自英国菌种保藏中心（NCTC），具有ATCC编号。

为避免给实验室带来污染，支原体均经过灭活，并且为冻干粉形式，4℃保存，性能稳定。

每种支原体灵敏度标准品提供有CFU与GC（基因组拷贝数）的换算数值（详见质控证书）。

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