qPCR快检水中的微生物，第yi步是提DNA

现在检水多采用微生物培养法，常见所检的细菌有军团菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。现在，qPCR方法更多的可用于水质检测以及上述微生物的定量检测。

可以采用德国MB公司的水中微生物DNA提取试剂盒（英文名：AquaScreen® Fast Extract）用于从水样中提取微生物DNA。该试剂盒遵循ISO/TS 12869:2012的设计要求。提取的DNA可用于下游的PCR或qPCR检测。

一、适合的样本：

包括饮用水、浴池水、泳池水及废水等。

二、工作原理：

该试剂盒采用0.4μm滤膜截获微生物，然后微生物被加入到滤膜上的离子活性剂和促溶剂裂解。随后进行DNA抽提。

DNA抽提由四步组成：1. 菌体裂解

2. DNA与离心柱的特异结合

3. 祛除残留污染物和抑制剂

4. DNA的洗脱

整个过程大约30分钟。

三、产品组成：

四、需用户自己准备的试剂耗材和仪器：

1. 水过滤设备（滤器、真空泵等）

2. 无水乙醇

3. 反应管（1.5ml或2ml）

4. 离心机

5. 恒温仪

6. 移液器及带滤芯吸头（100ml和1000ml）

7. 恒温箱

五、样本制备须知：

1. 饮用水、浴池水、泳池水及废水可作为样本。样本性状会影响结果的可靠性，并需要与ISO的水样采集指南一致（ISO Norm 5667-1至5667-10）。

2. 水样应在2-8°C保存，在采集的2天内检测。不推荐使用防腐剂，因为会使菌体裂解，而滤膜只能截留完整的菌体。

3. 若水样中有悬浮颗粒或固定挥发性成分，则需先用滤纸过滤。

4. 样本不能离心。

5. 该试剂盒所需样本体积建议为1000ml。样本体积少应为100ml。

6. 该试剂盒不会截获水中游离的DNA。

7. 该试剂盒不能区分“活的可培养微生物”与“活的不可培养微生物”。

六、操作注意事项：

1. 该试剂盒只用于科研，并且应仅由经过培训的实验室人员使用。
2. 所有样本应视为有潜在危害性，应小心处理。
3. 应始终穿上合适的防护fu，戴一次性手套和护目镜。
4. 请勿向废弃液体中加漂白剂或酸性溶液。如有液体溅出，请用合适的去污剂和清水处理。
5. 废弃物可根据当地法规进行处理。
6. Binding Buffer（结合液）含异丙醇和聚乙二醇辛基苯酚醚，易燃、有害、有腐蚀性。
7. Wash Buffer 1（洗液1）含硫氰酸胍，有害、有腐蚀性。

七、样本制备步骤：

（一）操作步骤概览

（二）操作步骤详解

步骤1. 样本过滤

1.1 从试剂盒中小心取出滤膜。用水样润湿滤膜。

1.2 将滤膜放置在滤器中，并过滤必要体积的水样。

步骤2. 菌体裂解

* 提前准备：预先将恒温仪设置到70℃，将恒温箱设置到37℃。

2.1将样本过滤后的滤膜翻转放置到试剂盒提供的Incubation Dish（平皿）中。

2.2 吸取2ml lysis buffer（裂解液），并加到滤膜上。

2.3 将滤膜浸泡在裂解液中，小心摇匀平皿并在37°C孵育30分钟。

2.4 用平皿中的裂解液冲洗滤膜，并摇晃平皿10秒钟。

2.5 将平皿中的400 μl裂解液转移至Incubation Tube（孵育管），70 °C孵育10分钟。

2.5a可选项：剩余裂解液可再取400μl用于DNA抽提，以获得更多的DNA样本。

2.6 样本短暂离心，并加入400 μl Binding Buffer（结合液），立即涡旋充分混匀，以防止DNA沉淀。请勿离心样本，并立即进行下一步。

步骤3. DNA提取

* 提前准备：（1）Wash Buffer 1（洗液1）和Wash Buffer 2（洗液2）第yi次使用前，用无水乙醇复溶（请参见瓶上标签）

（2）将恒温仪设置到70℃，并将Elution Buffer（洗脱液）放在上面预热。

3.1 将步骤2.6中的混合液（~800 μl）转移到Collection Tube（收集管）内的Spin Column（离心柱）中，小心液体不要沾到离心柱的边缘。

3.2 离心柱离心≥10000 × g，1分钟。弃掉收集管中的液体。重新将离心柱插到原有的收集管中。

3.2a 可选择：在步骤2.5a中，多取的一份样本重复以上操作，不用换离心柱。

3.3 离心柱中加入500μl洗液1。离心≥10000×g，1分钟。弃掉收集管中的液体。重新将离心柱插到原有的收集管中。

3.4 离心柱中加入500μl洗液2。离心≥10000×g，1分钟。弃掉收集管中的液体。将离心柱插到一个新的收集管中。

3.5大速度离心3分钟，以去除残留的洗液2。

3.6弃掉收集管。将离心柱插入到试剂盒提供的Sample Storage Tube（样本保存管）中。

3.7吸取60μl已70℃预热的洗脱液，直接加到离心柱的硅胶膜上。硅胶膜表面应全部覆盖洗脱液。

3.8室温静置2分钟，然后离心8000×g，2分钟，以洗脱DNA。

3.9样本保存管中的洗脱液即包含DNA，可直接用于PCR，或储存在2~8℃，可存放1周。长期储存是在≤-18℃。

八、样本中的细菌数量计算

样本中的细菌定量需使用PCR定量标准品和qPCR检测试剂盒（推荐使用德国MB的PCR定量标准品和AquaScreen®qPCR检测试剂盒，详见“九、水中细菌精zhun测定，还需要的相关试剂”）

计算公式：基因组拷贝数/反应 × 比例因子× 校正因子× （1000/样本体积（ml））

= 微生物数量/升

注：

1. 样本中的基因组拷贝数：可通过标准曲线定量

2. 比例因子：取1份400ml裂解液，比例因子=5

取2份400ml裂解液，比例因子=2.5

取3份400ml裂解液，比例因子=1.67

3. 校正因子：60ml洗脱液中取10ml用于qPCR反应，校正因子=6

九、水中细菌精zhun测定，还需要的相关试剂：

总之，传统水质检查需要2-3天，qPCR法只需要2-3个小时，提取DNA只需要大约半个小时，更精zhun，更快捷。以上信息供参考，感谢缔一生物提供相关内容。