支原体 DNA染色法及其优缺点

支原体有多种检查方法，其中荧光法检测支原体DNA是药典记载的方法，又被称为DNA染色法或指示细胞培养法。它的原理和操作大致如下：

将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero 细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞，供试品应对该细胞生长无影响。下面以Vero细胞为例）中培养后，用特异荧光染料（如Hoechst 33258）染色。

Vero 细胞经消化后，需制成每1ml含10的5次方的细胞悬液，以每孔0. 5ml接种到6孔细胞培养板。每孔再加无抗生素DMEM培养基3ml，在细胞孵箱培养过夜，备用。

无抗生素培养基中加入供试品后，细胞需至少传一代，然后取细胞已长满且3 天未换液的细胞培养上清液待检。

在制备好的指示细胞培养板中加入2ml待检细胞培养上清，36°C培养3-5 天。指示细胞培养物至少传代1 次，末次传代培养用含盖玻片的6孔细胞培养板培养3-5 天后，吸出培养孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟，吸出固定液，再加5ml 固定液固定10分钟。再次吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥，加

DNA 染料工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，洗3 次，干燥，封片。用荧光显微镜观察。

阴性对照仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。阳性对照荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。有污染的供试品表现应与阳性对照相同。

支原体DNA染色法的优势是：

1.适用于一些不易培养的支原体，如猪鼻支原体，分离培养法对该支原体检测并不可靠，但可用DNA染色法准确地检测出来。

2. 操作简单

3. 灵敏度尚可。

支原体DNA染色法的不足是：

1. 需4-14天后才出结果，时间较长。

2. 存在有假阳性和假阴性。如一些死亡细胞释放出来的DNA会造成很大干扰，使得判断误差发生率大约在30%左右，因此使用这个方法需要一定的经验。

因此，目前有一种趋势是进行支原体常规PCR和支原体qPCR的检测，只要支原体方法验证保证其灵敏度、特异性和稳定性，只要该方法与药典方法相比具有可比性，即可代替培养法或DNA染色法。

方法验证可通过一些支原体标准品来进行，同时需要注意的是，样本都需经过DNA抽提，否则其中可能含有抑制PCR反应的物质，导致灵敏度下降。

感谢北京缔一生物提供相关信息。