RNA病毒检测（RT-qPCR法）（新guan病毒研究推荐）

许多病毒都是RNA病毒，如新型管状病毒。上通行的检测方法是RT-qPCR方法。这就离不开RT-qPCR mix。下面给您介绍的这款Mix值得关注，因为它可用于新guan病毒研究检测（不用于诊断），是其中的一个重要组分。

一、用途

RNA病毒检测试剂盒（RT-qPCR法）（英文名：ConviFlex™RT-Taq mix）用于定性检测和分析RNA病毒和RNA分子，特别适合检测新guan病毒等此类病毒。

二、描述：

1.该试剂盒为实时定量qPCR（RT-qPCR）RNA病毒检测试剂盒。

2. 试剂盒由两种组分组成：

组分1.  ConviFlex™ RT-Taq Mix的冻干粉包含：MuLV逆转录酶、Taq聚合酶及dNTP。

其中MuLV逆转录酶，来自小鼠白血病病毒（M-MuLV）并经过基因修饰。

这里的Taq聚合酶另兼具热启动功能。

此Taq酶在室温下，活性被抗体所抑制，当温度达到70°C以上时，才会被*激活。

在70°C 以下时，由于Taq酶没有*活化，因此实验不会产生非特异性PCR产物和引物二聚体。热启动Taq酶的使用可使PCR具有更高的特异性和灵敏度。

3. 试剂盒使用时，先用复溶缓冲液溶解冻干粉，再加入自备的RNA模板和引物。

推荐使用MB公司提供的新guan病毒的引物/探针（英文名：SARS-CoV-2 Confirm，货号271-2100）

4. 该试剂盒适合大多数RT-qPCR体系和qPCR仪类型。关于实验使用的jia体积、浓度、温度和孵育时间，本文有相应的建议，但实验室仍可依据自己的分析要求作相应调整。

三、产品特点：

1. 冻干粉为逆转录酶和Taq酶的预混液，将RNA逆转录与qPCR扩增两个过程合并，一步完成，减少移液次数、避免交叉污染、操作简单，节约时间。

2. Taq酶具有70°C热启动功能，显著提高试剂盒的特异性和敏感度。

3. 主要组分为冻干粉，4℃保存，储存运输方便，性能稳定。

四、需用户自己准备的试剂耗材和仪器：

1. 引物、探针（可选）

推荐MB公司提供的新guan病毒的引物/探针（英文名：SARS-CoV-2 Confirm，货号271-2100）

2. 荧光定量PCR仪（qPCR仪）

3. 无DNase和RNase的qPCR反应管

4. 离心机

5. 移液器及带滤芯吸头（不含DNase和RNase）

6. 用户自己的样品。

五、样本制备说明：

1. 来自于真核细胞、原核细胞、病毒的RNA以及体外转录的RNA，均可用于检测。

2. 制备的RNA必须不含RT-qPCR抑制剂，例如有机溶剂等。

3. 尽量减少RNA样品的冻融次数，同时避免RNA酶污染，以减少RNA降解的风险。（RNA降解会极da地限制了RT-qPCR反应的性能）

4. 样本制备过程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干扰也会降低qPCR的准确性。

建议采用商品化的RNA提取试剂盒预先处理待检物（如拭子、活检组织、哺乳动物细胞和细菌），例如MB厂家的：

【RNA小提试剂盒】（英文名：ExtractNow™ RNA Mini Kit，货号603-1050）

【病毒RNA提取试剂盒】

(英文名：ExtractNow™ Virus RNA Kit, 货号611-1010/-1050/-1250)

或使用其他已建立的方法。

六、操作注意事项：

该试剂盒应仅由经过培训的实验室人员使用。始终穿上合适的防护fu和戴一次性手套。

根据样品类型，应谨慎处理所有样品。该试剂盒不含有害物质。残余物可以根据当地法规丢弃。

七、操作步骤

步骤1. 冻干粉ConviFlex™RT-Taq Mix，大速离心5秒钟，然后加入260μl复溶缓冲液2×Rehydration Buffer，室温静置5分钟后，涡旋并离心5秒钟，分装，待用或-18℃保存。

步骤2.  每个反应体系为20µl，其中反应mix为15µl。

（1）依据本次试验样本数，制备RT-qPCR的反应mix。

1个反应mix需要：

①ConviFlex™ RT-Taq Mix（即上面复溶的预混液）10µl，

②引物（浓度0.1 - 0.5 µM）

③探针（浓度0.1 - 0.5 µM）

④PCR级水（使每管总体积为15µl）

注：引物和探针的推荐浓度范围是0.1-0.5 μM。

通常，引物浓度过高，会增加引物错配和非特异RT-PCR产物。然而，当RT-PCR程序运行时间较长或使用简并引物时，则推荐引物浓度升高至1 μM。（注意：若使用简并引物，同一RT-PCR分析中，引物之间应具有相同的熔解温度）

（2）将反应mix涡旋并离心5秒钟。

（3）每个PCR管中加入15μl反应mix和5μl样本（抽提后的RNA），

或5μl RNA提取试剂盒中的洗脱缓冲液，作为阴性对照，或5μl PCR级水作为无模板对照，或5μl阳性对照。

（4）扣紧PCR管，然后短暂离心。

（5）将PCR管放置qPCR仪上，盖好盖。

步骤3. 在qPCR仪上设置反应程序，

示例:  1 cycle   50 °C for 20 min

1 cycle   95 °C for 10 min

45 cycles 95 °C for 15 sec

60 °C for 1 min

 (以上程序仅依据厂家经验，用户可根据实际情况调整温度和孵育时间)

步骤4. 启动程序

八、使用注意事项：

1. 使用前应认真阅读说明书。

2. 来自不同批次的试剂不能混合。

3. 试剂盒内的试剂应始终作为一个整体溶解分装。

4. 试剂盒应在效期内使用。

5. 每次PCR至少应设置一个阳性对照。每次PCR至少应设置一个阴性对照和/或一个无模板对照。如果实验者自己抽提RNA，则可使用洗脱缓冲液作为阴性对照。对照必须与待测样品的处理方式相同。您也可能需要其他实验室提供的对照品，例如含高、中、低不同浓度的RNA样品。使用对照，对于确认结果的可靠性或用于排除故障非常有意义。

6. 建议在无RNA和DNA污染的条件下进行RT-PCR，以避免操作过程中DNA或非特异RNA的交叉污染。（MB公司推荐使用PCR污染祛除喷雾，英文名：PCR Clean™，货号15-2025，预先清洁实验环境。）

7. RNA模板浓度，应依据提取RNA的质量、来源、感兴趣基因的相对丰度、以及是否为低拷贝基因，来调整优化。

8. 该试剂盒建议逆转录步骤的温度为50°C。但这个温度及持续时间可根据实验室自己的分析要求进行优化，以增强反应的性能。