乳品工业需求下的微生物分析方法的演进

发酵微生物在发酵食品物理化学和感官特性方面起着关键作用。它们也与食品安全相关，因为需要限制病原微生物和微生物的生长。因此，细胞活力的评估对于发酵食品工业（特别是乳品部门）通常是非常重要的。由于发酵微生物与食品的感官特性密切相关，因此需要有能力判别细胞的分裂能力，而且需要确定其代谢活动和适应性，以改善质量控制和终产品。对于益生菌产品，若要对健康产生益处，则还需要确保存在足够数量的活细胞。

已有一些方法用来分析参与发酵过程的微生物种群的特征。传统是采用描述性的培养方法，它仍然是确定菌落（即可培养细胞）存在与否及其数量的常用的方法。然而，这些简单的方法在微生物种群生理状态方面也存在一定的偏差，特别是其中共存几个不同生存活力和代谢活性的亚群。于是又诞生了一些分子技术，能够描述微生物中间状态，以及通过标志物定量来判定菌群健康程度及新陈代谢活力的方法，而非仅仅对其生长和不生长进行定量。分子方法包括荧光原位杂交、流式细胞术、组学及PCR技术。PCR技术已在常规得到引用。

培养法是传统常用的方法，其局限是缺乏目标菌和伴随菌之间的鉴别、得出结果的时间、假阳性计数、食品基质影响、存在一些活而不可培养的细胞（简称VBNC）（即垂死细胞）。VBNC是上世纪80年代才认识到的，因而用活/死细胞染色检测试剂盒或RT-PCR来鉴别细胞是能分裂、还是VBNC，或死亡。现在已经认识到，在活细胞和死细胞之间，存在许多中间状态。而培养法产生的细胞对应的都是能分裂的细胞。

而人们对培养法仍然注入了许多兴趣，培养基得到了改进和发展，例如用于益生菌和非益生菌的选择性计数，酸奶、奶酪和发酵剂中双歧杆菌的选择性计数等。使用不同的琼脂平板培养基，可以对许多商品进行益生菌存活率的评估。这些商品包括浓缩粉、冷冻材料、胶囊、食品和饮料等。可以确定保证活菌低数量的益生菌效期。酸奶和奶酪中益生菌存活的影响因素也得到了研究。但由于培养法也存在一些不足，因此推荐同时采用分子鉴定的手段进行验证，以保证结果的准确性和可靠性。这对于益生菌计数尤为重要，因为要保证必要的数量。

图2. HiMedia公司生产的乳杆菌显色培养基（品名，HiCrome™ Lactobacillus Selective Agar Base，货号M2065，需添加剂FD345），用于乳杆菌的分离和内部鉴别。嗜酸乳杆菌菌落淡粉色-粉色，鼠李糖乳杆菌菌落为淡绿色，发酵乳杆菌菌落为黄色，胚牙乳杆菌菌落和乳酸乳球菌乳酸亚种菌落均为淡绿色-绿色（光晕）

图2. HiMedia公司生产的双歧杆菌显色培养基(品名：HiCrome™ Bifidobacterium Agar，货号M1960)，用于双歧杆菌和乳杆菌之间的鉴别。婴儿双岐杆菌菌落为深蓝色至蓝绿色，短双歧杆菌菌落为粉红色（有光晕），植物乳杆菌菌落为绿色（有雾状背景），发酵乳杆菌菌落为粉色无光晕。

用于致病菌分析的显色培养基也发展起来了，并进行了验证和标准化。的确，李斯特菌、沙门菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌及其他肠道菌可通过大量颜色鉴别出来。显色培养基使用方便，不需要分子生物学方面的知识。这在乳品微生物质控方面，无疑非常重要。其发展对弥补特异方法的不足也有帮助。

镜检、流式细胞术和其他荧光标记方法是否适合食品企业？将荧光原位杂交（FISH）用于乳品微生物计数已有数篇报道，例如奶酪中的丙酸杆菌检测和计数。FISH具有高特异性，可观察细菌在环境中的空间分布。FISH的不足是可重复性低，容易有假阳性和干扰，因而用于常规分析较为困难。流式细胞术（FC）可用于单细胞分析，能鉴别各种VBNC和生理状态。FC已成为有前景的标记计数，并在食品微生物学领域已有许多报告。一些荧光染料针对细胞某些组分（如核酸、蛋白质、脂类）、细胞内pH值、膜完整性和细胞内离子、活力标志物和膜能量状态。也可采用几种染料同时进行分析。一些学者用FC研究了食品生产或存储过程中遇到的酸、氧化、渗透压、冷应激对微生物细胞状态的影响。批次培养的群体动力学、细菌噬菌体感染的早期检测、奶酪加工温度导致的膜变化以及抗生素效应也得到了研究。FC也被建议用于益生菌活菌计数。在细菌指数生长期，FC计数和平板计数的一致性得到了确认。其他情况下，FC计数超过平板计数0.3–1的对数数量级(CFU/g)。FC所需的分析时间更短，且可自动化。但FC无法区分属和种，且检测阈值较高，在牛奶中达到103 –104细胞/ml。

FC也需要一些经验，并且有时存在假阳性。

尽管如此，FC仍然是食品工业有前景的分析工具。除了计数简单外，FC也能提供更多细胞活力的相关信息。它有益于益生菌产品的质控。2005年，ISO发布了ISO 19344:2015，推荐了用流式细胞术测定与牛奶和奶制品相关的发酵剂、益生菌和发酵制品中乳酸菌的数量。

测序和组学的技术也发展起来，用于研究乳酸菌对环境的反应。组学也用于鉴定关键标志物，以筛选新的益生菌，并评估其生理状态。使用组学技术可理解微生物行为和细胞通路，以优化工业生产过程。

在食品工业，PCR已成为检测致病菌的常规方法，得到了ISO的认可，并发展为荧光定量PCR。这些来自比较基因组学的分析，被用于微生物群体定量、乳制品加工中微生物角色评估或同时鉴定乳酸菌和益生菌的多个菌种。PCR也用于评估食品加工过程中微生物的生理状态和活力。有一种区分活菌和死菌的方法是进行针对RNA而非DNA的RT-qPCR，但该方法仍然需要标准化。另外一种PCR方法是采用DNA嵌合染料PMA和EMA。它们只进入死细胞，能阻止DNA的PCR扩增。采用PMA-PCR和EMA-PCR进行益生菌产品中的活菌计数，发现其结果与平板计数一致性良好。

总之，目前人类对于发酵菌的生物学知识有助于开发基于菌株特异性生化反应的显色培养基。这些显色培养基比传统培养基更具有鉴别力，更为特异，有助于乳品工业的微生物控制。流式方法对分析乳品、酸奶和其他发酵乳中的混合菌群很有前景，可用于质控和产品保质期的研究。但它需要优化，并需去除乳蛋白。不论何种方法，都需与标准方法验证，并须进行方法学上的评估，以与乳制品企业的特定需求相一致。

参考文献

Danièle Sohier, et al. Evolution of microbiological analytical methods for dairy industry needs. Frontiers in microbiology. 2014, 5: 16

HiMedia公司是微生物培养基生产商，其显色培养基有80多种，涵盖各个领域，包括无动物源成分及化学限定。其生产工艺具有WHO-GMP、ISO9001和ISO13485质量体系认证认证，产品有CE和FDA注册登记，其产品行销140多个国家。