CCA显色培养基在水的标准检验中的应用

微生物检测产品生产商HiMedia Laborotaries公司生产的CCA显色培养基（货号：M1991I-500G，英文品名：HiCromeTM Chromogenic Coliform Agar）是一款值得注意的产品，因为它的成分和性能符合新版的ISO9308-1标准（2014版），而该标准论述的正是有关大肠杆菌和大肠菌群计数的水质的标准检验。

ISO9308-1.2014采用的是滤膜法联合CCA显色培养基法，用于水中大肠杆菌和大肠菌群的计数。它出结果的时间更短，只有24小时（而2000年版ISO9308采用乳糖TTC琼脂，需48小时），而且无须额外的培养基进行验证试验。

在CCA显色培养基中，大肠菌群（不含大肠杆菌）表达β-D-半乳糖苷酶，分解显色底物，从而为粉红色菌落；大肠杆菌同时表达β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸酶，表现为蓝紫色菌落；而其他非大肠菌群菌（如绿脓杆菌、沙门氏菌）为无色；粪肠球菌的生长则受到抑制。

图. HiCromeTM CCA显色培养基培养反应

为什么要同时检测大肠菌群和大肠杆菌？对于人类来说，水被粪便污染一直是一个问题。大肠杆菌，其实是人肠道的正常菌群，它随粪便被排出体外，因而被看作是水是否被粪便污染的指示菌。大肠菌群则较为复杂，因为有的大肠菌群生活在土壤和新鲜的地表水中，并不总是在人的肠道内。大肠菌群并不作为粪便污染的指征，但可以指示出水在净化、储存和运输过程中存在的问题。

ISO9308-1.2014中的操作方法大致如下：先取水样100ml（或其他体积），在5±3℃运输和保存。应保证在取样的24小时内检测。再将水样用滤膜过滤。过滤膜应47mm或50mm直径，0.45μm孔径，有网格线，并且需保证无菌。过滤后细菌就被截留在滤膜上，然后将滤膜贴到CCA显色培养基上。放置时应保证下面没有气泡。然后倒转平板，孵育21±3小时，36±2℃。之后就可检查过滤膜上的菌落并计数。

ISO9308-1.2014指出，显色后，大肠菌群（粉红色菌落）应再用氧化酶试纸条进行验证试验（大肠菌群为氧化酶阴性），因为一些氧化酶阳性菌(如气单胞菌属)可能带来假阳性。具体是应至少选择10个粉红菌落，进行氧化酶试验，或向平皿中的滤膜滴加氧化酶试剂2-3滴，阳性反应为深蓝色（30秒内）。大肠杆菌无须验证。如需验证时，可进行吲哚试验。大肠杆菌为吲哚试验阳性，而其他大肠菌群为阴性。

值得指出的是，该标准方法选择性不强，它适合低菌群背景的样本，因为背景生长可能干扰计数。ISO指出，它适合菌落数小于100的水样，例如：饮用水、自来水、消毒的池水，而对于地表水和井水，该方法并不适合。

注意：对于大肠杆菌O157，CCA培养基不会将其识别为大肠杆菌。大肠杆菌O157将被识别为大肠菌群。对于总大肠菌群计数，它应等于氧化酶阴性的粉红色菌落数+蓝紫色菌落数。

据ISO资料显示：CCA培养基的灵敏度为94%（大肠杆菌）和91%（大肠菌群），特异性为97%（大肠杆菌）和94%（大肠菌群），可见性能还是相当不错的。而HiMedia公司更提供有化学限定的CCA显色培养基，这保证培养基的批间差异极小，批次结果稳定，重复性和准确度进一步提升。

我国《GB8538—2016食品安全国家标准·饮用天然矿泉水检验方法》提到滤膜法计数大肠菌群。具体是将过滤水样的滤膜贴在选择性鉴别培养基上，经 37℃ 培养24h后，大肠菌群细菌在滤膜上长出具有特征性的菌落，直接计数典型菌落数，计算出每 100mL 水样中所含的大肠菌群数。所用培养基为远藤琼脂(品红亚硫酸钠)培养基。长出的菌落还需进行革兰氏染色镜检观察。如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液，经36℃±1℃培养 24h±2h 后，如产酸产气则判定为大肠菌群阳性。整体耗时较长，步骤较多。

《GBT5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法——微生物指标》检测指标包括总大肠菌群和大肠埃希氏菌，都提到酶底物法。总大肠菌群也是根据用选择性培养基上筛查β-半乳糖苷酶阳性菌，并提到“可选用市售商品化制品，以此计数来检测水中总大肠菌群”。大肠埃希氏菌是根据β-葡萄糖醛酸酶。检测方法是两类菌分开论述的。而CCA显色培养基可同时计数并鉴别这两类菌，不可不谓具有更高的效率。

据悉，上海市质量技术监督局已通知，将要更新发布《DB31/T 1091-2018 生活饮用水水质标准》，2018年10月1日开始实施。这虽然是地方性的条例，但毕竟对2006年的国标进行了一些改进，估计可能会采纳ISO9308-1.2014的方法。